技术评论

对“昼夜节律核心基因核心节奏的回应”BMAL1

查看全部隐藏作者和联系

科学2021年4月16日:
卷。372,问题6539,EABF1941
DOI:10.1126 / science.abf1941

摘要

Abruzzi.。争论在我们的研究中发现的转录组振荡BMAL1振幅低,有统计学意义,一致性好。然而,他们的结论仅仅依赖于与我们使用的不同的统计算法。我们提供统计措施和其他分析,表明我们的原始分析和观察是准确的。此外,我们强调了一些独立的证据表明BMAL1- 依赖于24小时分子振荡。

在他们的评论中,Abruzzi。(1)在没有的情况下挑战我们对昼夜昼夜分子振荡的观察BMAL1。我们被作者通知,并独立发现,处理肝脏RNA-SEQ数据的基因型在分析期间被错误(在错误中纠正)。然而,这不会影响纸张的主要结论。仍然存在振荡BMAL1- / -。反转这些数据不会更改此数据。所有其他数据,包括成纤维细胞RNA-SEQ,蛋白质组学和磷蛋白酶,展示昼夜节律BMAL1敲门声。校正基因型不会影响我们关于E26转化特异性(ETS)转录因子的推迟。在两个基因型中发现ETS因子,只有所涉及的具体因素发生了变化[图S6A(2)]。

Abruzzi.。给某事物发表意见BMAL1记录振荡BMAL1- / -组织。我们检查了BMAL1两种基因型的转录物。这表明淘汰局部缺失外显子5(目标区域)(3.),而转录的转录物的其他外显子(例如,7和8)与内含子一起转录(图。1A)。因此,通过我们使用的RNA-SEQ管道量化,转录物振荡,这是我们使用的全转录量定量。成熟的成绩单BMAL1- / -然而,将产生截短的无官能蛋白质,该蛋白质未被检测到。这是最初描述的,我们通过免疫印迹找到了相同的[图S4a(2)](23.)。我们发现BMAL1也是有节奏的bma1l.+/+组织,Cry2图。1B)。

图1 检测到大量的节奏转录物BMAL1- / -肝组织使用不同的算法和统计阈值。

一种)基因组浏览器视图ARNTL.BMAL1)野生型的成绩单BMAL1- / -肝脏组织。对于峰值(CT21)和谷(CT33)的两个基因型显示出外显子3到外显子8的序列读数。外显子5在淘汰之中扰乱。(B.)节奏表达(日志2转型FPKM)Cry2在野生型肝组织中(FDR <0.05)。(C)在不同的统计严格程度(使用三种不同的算法:RAIN、调和回归(HR)和JTK_cycle)中识别的数千个24小时振荡转录本BMAL1- / -肝组织(纠正基因型切换后)。(D.[]示意图,示出了如何在我们的研究中计算众幅度作为峰 - 低谷比率(折叠变化)。(E.)野生型和野生型节律基因的波幅[峰谷比(折变)]BMAL1- / -肝组织(RAIN FDR < 0.1, 24小时周期)。(F)在(10.)。

Abruzzi.。显示了JTK_CYCLE的结果,所有分析都没有将他们的发现与雨量进行比较,所用的主要算法(2)。如上所述(2),我们使用了雨,因为它能够检测到相对于JTK的不对称昼夜型型材(例如,非轴线图案)及其优异的敏感性(4.)。JTK不是该领域的“黄金标准”。根据“生物节奏的基因组分析指南”(5.),不存在金本位制度(4.)。大多数研究使用一系列方法来定义昼夜节律,如我们所做的[图S1C(2)](5.)。没有理由认为专门的JTK分析优于我们的分析。

给予Abruzzi.。的索赔,我们对原料进行了比较P.值和FDR调整P.通过JTK产生的雨量的价值,以及谐波回归(HR),昼夜昼夜检测的另一种有效方法(6.)(图1C.)。我们发现的[图S1c(2)],JTK给出了任何统计阈值的雨量的数量,而HR给出了雨量的可比数量(图1C.)。从检查他们的代码,我们注意到Abruzzi。使用HR和JTK同时进行分析,但没有在他们的评论中显示HR结果(原因未透露),并且只关注JTK。此外,JTK中的FDR比真正的FDR (7.);也就是说,JTK低估了节奏转录本。

许多最近的昼夜转录组研究,包括由Abruzzi和Rosbash出版的那些,使用低统计严格性(即,P.价值S.没有FDR调整)以获得节律转录组的更深覆盖率(8.9.)。在Abruzzi.。(2017),例如,它们状态“JTK_CYCLE将成绩单确定为骑自行车...... aP.-Value截止小于0.05“(8.)。这些作者的另一个纸张使用了P.< 0.05 cutoff (9.)。目前尚不清楚为什么这条评论的作者对自己发表的工作产生了不太严格的统计截止物,而是坚持我们的工作所需的更严格的标准。无论如何,选择哪种算法,有数百到数千名记录,在FDR <0.05或0.1时显示昼夜振荡BMAL1- / -

图S3a中所示的幅度(2)表示为峰槽比。这在图例中表示。“幅度”和“折叠变化”在该领域中可互换使用(5.)。我们使用峰谷比,因为RAIN不计算振幅作为输出。JTK使用的计算确定了与中值表达式的偏差,这将至少是峰到谷值的一半。因此,除非重新调整其振幅,否则它们的振幅不会与我们的一致。我们发现节奏转录本的振幅分布类似BMAL1+/+BMAL1- / -图1E.)。此外,振幅分布与霍塞彻组的早期肝昼夜转录组研究相当(10.)(图。1F.)。

我们不同意Abruzzi在37°C不同的数据集中有节奏的转录本数量的结果。我们使用了另一种度量,要求转录本在至少两个数据集中具有节律性,以确定一致的节律性(图2,A和B.)。可能没有预期在所有数据集之间交叉数量的高数量;Circadian Meta-Analys的同一组织表现出很少的一致性(11.)。因此,鉴于这种数据集之间的已知变异性,我们认为所有数据集的交叉都是一个公平的比较。此外,看似相同的成纤维细胞的克隆没有显示出与生成产生相同的昼夜节律特征。这引入了传代细胞中的进一步变异性,其可以解释我们的转录组数据集中看到的一些可变性(12.)。

Fig. 2 Overlap among rhythmic transcripts identified in different Bmal1–/– mouse skin fibroblast (MSF) experiments.

(A) Rhythmic transcripts (RAIN, FDR < 0.1) identified in at least two of four Bmal1–/– MSFs experiments performed at 37°C. Results represent a significant overlap (521/3790, 14% of all identified rhythmic transcripts) among the datasets. (B) Overlap among rhythmic transcripts (RAIN, FDR < 0.1) identified in 27°, 32°, and 37°C Bmal1–/– MSF datasets (585/3488 in at least two of three datasets, 17% of all identified rhythmic transcripts). (C) Rose plots representing the frequency distribution of the phases of cycling transcripts identified in Bmal1+/+ and Bmal1–/– liver tissues in our study (2). We compared our data with the phase distribution of cycling genes (exon) in wild-type mouse liver as demonstrated in (13) (whole-transcriptome RNA-seq analysis). (D) Phase difference distribution for the rhythmic transcripts (RAIN FDR < 0.1) in AM and PM datasets (Bmal1–/– fibroblasts synchronized 12 hours apart). (E) Many of the identified rhythmic transcripts in AM and PM datasets exhibited antiphase rhythms in Bmal1–/– MSFs (phase difference 9 or 12 hours). Oppositely phased abundance profiles (log2 transformed FPKM) of a few representative rhythmic genes (RAIN, FDR < 0.1, in addition to those shown in the original manuscript). Samples from three biological replicates were pooled together for RNA-seq analysis at each time point. (F and G) Venn diagrams showing overlap between rhythmic transcripts (RAIN FDR < 0.1) identified in Bmal1–/– MSFs (if rhythmic in any of the 37°C datasets) (F) and Bmal1–/– liver tissues (G) in our study (2) and in Bmal1–/– epidermis (KO-ArntlstopFL/stopFL) under constant conditions (DD), as identified in (14) (GEO accession: GSE114943; FPKM values reanalyzed using the RAIN algorithm).

" data-icon-position="" data-hide-link-title="0">
图2 在不同BMA1- / - 小鼠皮肤成纤维细胞(MSF)实验中鉴定的节奏转录物之间的重叠。

一种)至少两个中的至少两个中鉴定的节奏转录物(雨,FDR <0.1)BMAL1- / -MSFS实验在37℃下进行。结果代表数据集中的显着重叠(521/3790,1521/3790,所有识别的节奏转录物的14%)。(B.节律转录本(RAIN, FDR < 0.1)在27°、32°和37°C存在重叠BMAL1- / -MSF数据集(至少两个三个数据集中的至少两个585/3488,占所有识别的节奏转录物的17%)。(C)玫瑰图代表了被鉴定的循环转录本阶段的频率分布BMAL1+/+BMAL1- / -我们研究中的肝脏组织(2)。我们将我们的数据与野生型小鼠肝脏中循环基因(外显子)的相分布进行了比较。13.)(全转录组RNA-SEQ分析)。(D.)AM和PM数据集的节奏转录物(Rail FDR <0.1)的相差分布(BMAL1- / -成纤维细胞相隔12小时同步)。(E.)AM和PM数据集中的许多已识别的节奏转录物表现出抗磷酶节奏BMAL1- / -MSFS(相位差9或12小时)。相对相位的丰富概况(日志2转化为少数代表性节奏基因的FPKM(雨,FDR <0.1,除了原始稿件中所示的那些)。将来自三个生物重复的样品在每个时间点一起聚集在一起进行RNA-SEQ分析。(FG)Venn图,显示在节奏转录物(雨FDR <0.1)之间的重叠BMAL1- / -MSFS(如果在37°C数据集中的任何一个中有节奏)(f)和BMAL1- / -肝脏组织(g)在我们的研究中(2)和在BMAL1- / -表皮(Ko-ARNTL.stopfl / stopfl.)在恒定条件下(DD),如(14.)(Geo加入:GSE114943;使用雨算法重新分析FPKM值)。

Abruzzi.。推测转录组振荡BMAL1- / -细胞和组织受到“无意识的日常干预”的外部驱动。我们竭尽全力确保条件不变。在同步和采样阶段,温度保持不变[图S1B (2)]。在地塞米松同步后没有发生介质变化。在轻致密的培养箱中保持恒定的黑暗板。孵化器位于抗振动台上,以最大限度地减少振动。样品收集是由培训的人员以随机的方式完成的。此外,相分布与体内肝脏RNA-SEQ数据中的相似非常相似(13.),落入两个主要阶段(图2C.)。这是预期的,而不是不寻常(如声明)。

最后,关于纤维母细胞的差异夹带,Abruzzi。显示一些不响应相对夹带的基因。鉴于并非所有转录物都会显示这种行为,这种成绩单并不令人惊讶。然而,大量的转录物确实显示了预期的行为(N= 83在AM和PM数据集之间显示9-或12小时的相位差),我们在此提供进一步的示例(图2,D和E)。因此,它们的断言特定的转录物(由其过滤器定义)表示误认为是总体结果。

还有其他的证据吗BMAL1敲门声?韦尔兹。使用不同的皮肤发现昼夜振荡BMAL1淘汰赛模型(14.)。与我们的数据的比较表明,在皮肤成纤维细胞数据和体内表皮数据中,882转录物重叠(图2,f和g)。此外,BMAL1- / -皮肤成纤维细胞在恒定条件下显示昼夜代谢通量振荡(15.)。这些数据提供了进一步的自我持续昼夜振荡证据BMAL1- / -恒定条件下的细胞和组织。

参考文献

致谢: 资金:A.B.R.承认宾夕法尼亚大学佩尔塞尔曼医学院的资助,以及宾夕法尼亚大学佩尔塞尔曼医学院的翻译医学和治疗学(ITMAT)。作者捐款:概念化和写作,a.b.r.,s.r.和u.k.v;所有作者都同意对数据的解释并批准了稿件的最终版本;分析和可视化,A.B.R.,S.R.和U.K.V;资金收购,A.B.R.利益争夺:作者声明没有竞争利益。数据和材料可用性:RNA-seq数据可在基因表达Omnibus(登录号GSE111696和GSE134333)上获得。分析脚本可在GitHub (https://github.com/reddyslab/bmal1paper.)。

保持联系到科学

主题

导航本文