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回应关于“没有生物钟基因的昼夜节律”的评论BMAL1

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科学2021年4月16日:
第372卷,6539期,1941年
DOI: 10.1126 / science.abf1941

抽象的

Abruzzi。认为转录组振荡在我们的研究中没有发现BMAL1幅度低,统计显着性和一致性。然而,他们的结论完全依赖于我们使用的统计算法。我们提供统计措施和额外的分析,表明我们的原始分析和观察是准确的。此外,我们突出了独立的证据表明BMAL1- 24小时独立分子振荡。

Abruzzi在他们的评论中写道。(1)在没有的情况下挑战我们对昼夜昼夜分子振荡的观察BMAL1。我们被作者通知,并独立发现,处理肝脏RNA-SEQ数据的基因型在分析期间被错误(在错误中纠正)。然而,这不会影响纸张的主要结论。仍然存在振荡BMAL1- / -。颠倒这些数据不会改变这一点。所有其他数据,包括成纤维细胞rna序列,蛋白质组学,和磷蛋白质组学,都显示了昼夜节律BMAL1淘汰赛。纠正基因型不影响我们对E26转化特异性(ETS)转录因子的推断。在两种基因型中都发现了ETS因子,只是改变了所涉及的特定因子[图S6A (2)]。

Abruzzi。给某事物发表意见BMAL1转录振荡BMAL1- / -组织。我们审查了这一点BMAL1两种基因型的转录本。这表明第5外显子(目标区域)在敲除中缺失(3.),而转录本的其他外显子(例如,7和8)与内含子(图。1A)。因此,我们使用的RNA-seq管道进行全转录本定量时,转录本会发生振荡。成熟的转录本BMAL1- / -但是,会产生一种截断的、没有功能的蛋白质,这种蛋白质不会被检测到。这是最初描述的,我们通过免疫印迹发现了相同的结果[图S4A (2))(2,3.)。我们发现BMAL1也是有节奏的Bma1l+/+组织,如Cry2.(图。1B)。

图。1 检测到大量的节奏转录物BMAL1- / -使用不同算法和统计阈值的肝组织。

(一个)基因组浏览器视图ARNTL.(BMAL1)野生型的成绩单BMAL1- / -肝脏组织。从第3外显子到第8外显子的序列读取均显示在高峰(CT21)和低谷(CT33)处。第5外显子在敲除过程中被破坏。(B)节奏表达(日志2转型FPKM)Cry2.野生型肝组织(FDR < 0.05)。(C)在不同统计严格水平的数千次24小时振荡转录物[使用三种不同的算法:雨,谐波回归(HR)和JTK_CYCLE]BMAL1- / -肝组织(纠正基因型切换后)。(D在我们的研究中,振幅是如何以峰谷比(fold-change)计算的示意图。(E野生型和野生型基因的幅度[峰 - 槽比(折叠变化)]BMAL1- / -肝组织(雨FDR <0.1,24小时)。(F(如在()中报告的小鼠肝脏中,我们的数据与循环转录物(使用微阵列分析)的幅度的比较分析(10.)。

Abruzzi。显示了JTK_CYCLE的结果,所有分析都没有将他们的发现与雨量进行比较,所用的主要算法(2)。如(2),我们使用了RAIN,因为它能够检测不对称的昼夜节律(例如,非正弦模式),并且它相对于JTK (4)。JTK不是该领域的“黄金标准”。根据《生物节律基因组尺度分析指南》(5),没有黄金标准存在(4)。大多数研究使用一系列方法来定义昼夜节律模式,正如我们所做的那样[图S1C (2))(5)。没有理由,以便专门的JTK分析优于我们。

鉴于Abruzzi。的索赔,我们对原料进行了比较P价值观和FDR-adjustedP与JTK生成的值,以及调和回归(HR),另一种有效的昼夜周期检测方法(6) (图1C.)。我们发现的[图S1c(2)], JTK给出的任何统计阈值的转录本数量都低于RAIN, HR给出的数字与RAIN (图1C.)。从检查他们的代码,我们注意到Abruzzi。同时对HR和JTK进行分析,但没有显示HR的评论(未公开的原因),并仅关注JTK。此外,JTK中的FDRS比真实的FDR更保守(7);也就是说,JTK低估了节奏转录物。

许多最近的昼夜节律转录组研究,包括Abruzzi和Rosbash发表的研究,使用了较低的统计严格性(例如,P价值年代没有FDR调整的情况下),以获得更深入的节律性转录组覆盖(8,9)。在Abruzzi.。例如(2017),他们指出“JTK_cycle识别的转录本具有p-值截止小于0.05 " (8)。这些作者最近的另一篇论文使用了P<0.05截止(9)。目前尚不清楚为什么这条评论的作者对自己发表的工作产生了不太严格的统计截止物,而是坚持我们的工作所需的更严格的标准。无论如何,选择哪种算法,有数百到数千名记录,在FDR <0.05或0.1时显示昼夜振荡BMAL1- / -

图S3A所示的振幅(2)表示为峰槽比。这在图例中表示。“幅度”和“折叠变化”在该领域中可互换使用(5)。我们使用峰谷比,因为RAIN不计算振幅作为输出。JTK使用的计算确定了与中值表达式的偏差,这将至少是峰到谷值的一半。因此,除非重新调整其振幅,否则它们的振幅不会与我们的一致。我们发现节奏转录本的振幅分布类似BMAL1+/+BMAL1- / -(图1E.)。此外,振幅分布与Hogenesch研究组早期的肝脏昼夜转录组研究相似(10.) (图。1F.)。

我们不同意Abruzzi的观点。关于在不同37°C数据集之间的节奏数量的结果的结果。我们使用了一个需要转录物在至少两个数据集中是节律的替代度量,以识别始终节奏的节奏(图2 A、B)。不能期望所有数据集之间有大量的转录本交叉;对同一组织的昼夜节律元分析显示一致性不大(11.)。因此,我们不认为所有数据集的交集是一个公平的比较,因为已知这些数据集之间的可变性。而且,看似相同的成纤维细胞克隆并不一代一代表现出相同的昼夜节律特征。这进一步引入了传代细胞的可变性,这可以解释我们在转录组数据集中看到的一些可变性(12.)。

Fig. 2 Overlap among rhythmic transcripts identified in different Bmal1–/– mouse skin fibroblast (MSF) experiments.

(A) Rhythmic transcripts (RAIN, FDR < 0.1) identified in at least two of four Bmal1–/– MSFs experiments performed at 37°C. Results represent a significant overlap (521/3790, 14% of all identified rhythmic transcripts) among the datasets. (B) Overlap among rhythmic transcripts (RAIN, FDR < 0.1) identified in 27°, 32°, and 37°C Bmal1–/– MSF datasets (585/3488 in at least two of three datasets, 17% of all identified rhythmic transcripts). (C) Rose plots representing the frequency distribution of the phases of cycling transcripts identified in Bmal1+/+ and Bmal1–/– liver tissues in our study (2). We compared our data with the phase distribution of cycling genes (exon) in wild-type mouse liver as demonstrated in (13) (whole-transcriptome RNA-seq analysis). (D) Phase difference distribution for the rhythmic transcripts (RAIN FDR < 0.1) in AM and PM datasets (Bmal1–/– fibroblasts synchronized 12 hours apart). (E) Many of the identified rhythmic transcripts in AM and PM datasets exhibited antiphase rhythms in Bmal1–/– MSFs (phase difference 9 or 12 hours). Oppositely phased abundance profiles (log2 transformed FPKM) of a few representative rhythmic genes (RAIN, FDR < 0.1, in addition to those shown in the original manuscript). Samples from three biological replicates were pooled together for RNA-seq analysis at each time point. (F and G) Venn diagrams showing overlap between rhythmic transcripts (RAIN FDR < 0.1) identified in Bmal1–/– MSFs (if rhythmic in any of the 37°C datasets) (F) and Bmal1–/– liver tissues (G) in our study (2) and in Bmal1–/– epidermis (KO-ArntlstopFL/stopFL) under constant conditions (DD), as identified in (14) (GEO accession: GSE114943; FPKM values reanalyzed using the RAIN algorithm).

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图2 不同Bmal1 - / -小鼠皮肤成纤维细胞(MSF)实验中识别的节律性转录本的重叠。

(一个节律转录本(RAIN, FDR < 0.1)至少在四种转录本中有两种可以识别BMAL1- / -MSFs实验在37°C下进行。结果显示数据集之间存在显著重叠(521/3790,14%的节律转录本)。(B)在27°,32°和37°C中鉴定的节奏转录物(雨,FDR <0.1)之间的重叠BMAL1- / -MSF数据集(3个数据集中至少2个数据集中的585/3488,所有识别出的节律转录本的17%)。(C)表示所识别的循环转录物阶段的频率分布的玫瑰图BMAL1+/+BMAL1- / -我们研究中的肝脏组织(2)。我们将数据与野生型小鼠肝脏中的循环基因(外显子)的相位分布进行了比较,如(13.)(全转录组rna序列分析)。(D)节律转录本(RAIN FDR < 0.1)在AM和PM数据集中的相位差分布(BMAL1- / -成纤维细胞同步间隔12小时)。(E)在AM和PM数据集中,许多识别出的节律转录本显示出反相节律BMAL1- / -MSFs(相差9或12小时)。相反的阶段丰度剖面2转化为少数代表性节奏基因的FPKM(雨,FDR <0.1,除了原始稿件中所示的那些)。将来自三个生物重复的样品在每个时间点一起聚集在一起进行RNA-SEQ分析。(FG)显示节奏转录本(RAIN FDR < 0.1)重叠的维恩图BMAL1- / -MSFs(如果在任何37°C数据集中有节律)(F)和BMAL1- / -我们研究中的肝组织(G) (2),在BMAL1- / -表皮(KO -ARNTL.stopFL / stopFL)在恒定条件下(DD),如(14.) (GEO加入:GSE114943;使用RAIN算法重新分析FPKM值)。

Abruzzi。推测转录组振荡在BMAL1- / -细胞和组织由“意外的日常干预措施”外部驱动。我们走到了很大的长度,以确保恒定的条件。在同步和采样阶段期间温度保持恒定[图S1B(2)]。在地塞米松同步后没有发生介质变化。在轻致密的培养箱中保持恒定的黑暗板。孵化器位于抗振动台上,以最大限度地减少振动。样品收集是由培训的人员以随机的方式完成的。此外,相分布与体内肝脏RNA-SEQ数据中的相似非常相似(13.),落入两个主要阶段(图2C.)。这是意料之中的,而不是不寻常的(如声称的)。

最后,关于成纤维细胞,Abruzzi的差异夹带。显示一些不响应相对夹带的基因。鉴于并非所有转录物都会显示这种行为,这种成绩单并不令人惊讶。然而,大量的转录物确实显示了预期的行为(n= 83显示AM和PM数据集之间9或12小时的相位差),我们在这里提供进一步的例子(图2,D, E)。因此,他们认为特定的转录本(由他们的筛选器定义)表明了总体结果的断言是错误的。

是否有其他振动证据BMAL1淘汰赛中?Welz。使用不同的皮肤发现昼夜振荡BMAL1基因敲除模型(14.)。这些数据与我们的数据比较表明,我们的皮肤成纤维细胞数据和体内表皮数据之间有882个转录本重叠(图2,F和G)。此外,BMAL1- / -皮肤成纤维细胞在恒定条件下显示昼夜代谢助焊剂振荡(15.)。这些数据提供了进一步的自我持续昼夜振荡证据BMAL1- / -细胞和组织在恒定条件下。

参考

应答: 资金:A.B.R.承认宾夕法尼亚大学佩尔塞尔曼医学院的资助,以及宾夕法尼亚大学佩尔塞尔曼医学院的翻译医学和治疗学(ITMAT)。作者捐款:概念化和写作,a.b.r.,s.r.和u.k.v;所有作者都同意对数据的解释并批准了稿件的最终版本;分析和可视化,A.B.R.,S.R.和U.K.V;资金收购,A.B.R.利益冲突:作者声明没有相互竞争的利益。数据和材料可用性:RNA-SEQ数据可在基因表达式OMNIBUS上获得(登录号GSE111696和GSE134333)。分析脚本可在github上使用(https://github.com/ReddysLab/Bmal1Paper)。

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