技术评论

对“昼夜节律核心基因核心节奏的回应”Bmal1

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科学2021年4月16日:
卷。372,问题6539,EABF1930
DOI:10.1126 / science.abf1930

摘要

Ness-Cohn。声称我们在没有核心时钟基因的情况下对转录昼夜节律的观察Bmal1小鼠皮肤成纤维细胞的证据不足。他们声称,他们无法通过重新分析重现一些最初的发现。我们不同意他们的分析和展望。

尼斯科恩在他们的评论中写道。(1)重新分析了我们论文的一些内容,其中报道了皮肤成纤维细胞和肝切片中转录组、蛋白质组和磷蛋白质组的24小时振荡Bmal12)。作者着重研究了小鼠皮肤成纤维细胞(MSFs)中的转录组振荡。他们推测循环基因在Bmal1失效是由于“噪音”,而不是生理振荡。然而,我们不同意他们的立场,并讨论选择的参数如何影响分析。

Ray的数字如图1E所示。(2)反映了作为温度补偿实验一部分产生的37°C节律转录组数据的结果。在评审过程中,我们进行了这些附加实验,结果比初始实验更加一致,可能是因为37°C温度补偿实验中使用了更好的(2小时)采样分辨率。这篇评论的作者会意识到这种采样分辨率的影响,因为他们最近在这个主题上的工作(3.)。因此,我们根据这些数据更新了循环转录本的数量,同时绘制了原始72小时时间过程实验中相应转录本的热图(以保持其与肝组织时间过程热图的可比性)。不幸的是,在论文的修改过程中,我们并没有在图例中明确这一点。我们为造成的混乱表示歉意。

节奏转录物的数量(897Bmal1- / -, FDR < 0.1)。在37°C数据集(2小时分辨率)中与我们检测到的数字非常相似[请参阅图1B中的条形图(1)],如图1E所示(2)。实际上,我们看不到他们对我们的任何MSF数据集的识别节奏成绩单数量的任何显着差异(图1一个)。而且,在他们自己的分析中,ness-cohn。在另一个中检测到数千名节奏成绩单Bmal1在FDR < 0.1的敲除数据集,包括在AM和PM数据集的>2000节律转录本Bmal1淘汰(见图1B)1)]。我们认为这么大量的节奏成绩单可能是归因于“噪音”。

Fig. 1 Analysis of Bmal1 knockout transcriptomics data using various parameters, and the overlap of the different datasets.

(A) Comparative analysis of the number of identified rhythmic transcripts (RAIN independent method, FDR < 0.1) in Ness-Cohn et al. (1) and Ray et al. (2). All the data processing and analysis parameters are the same in both pipelines, except that we used a different peak_border (0.1, 0.9), which provided a slightly different (usually lower) number of rhythmic transcripts relative to Ness-Cohn et al. (B) The number of rhythmic transcripts detected in Bmal1–/– fibroblasts at 37°C (2-hour sampling, log2-transformed FPKM, RAIN, FDR < 0.1). Parameters are compared to those used by Ness-Cohn et al. (initial version of their analysis) and various FPKM thresholds after log2 transformation (RAIN longitudinal method). Comparison to Ray et al. parameters [all FPKM > 0, RAIN independent method, peak_border (0.1, 0.9)] is shown. (C) Overlap among the rhythmic transcripts (RAIN, FDR < 0.1) identified in different Bmal1+/+ (wild type, WT) and Bmal1–/– MSF experiments performed at 37°C. Bmal1–/– MSF datasets show a substantial number of transcripts (521/3790) rhythmic in at least two of four datasets. (D) Phase difference distribution for the rhythmic transcripts (RAIN, FDR < 0.1) in AM and PM datasets (12 hours apart, entrained) for Bmal1+/+ and Bmal1–/– fibroblasts; 83 rhythmic transcripts in AM and PM datasets exhibited antiphase rhythms in Bmal1–/– MSFs. (E) Oppositely phased abundance profiles (log2 transformed FPKM) of a few representative rhythmic genes not shown in Ray et al. (RAIN, FDR < 0.1 in both datasets). Samples from three biological replicates were pooled together for RNA-seq analysis at each time point. (F) LimoRhyde analysis indicating differential rhythmic transcriptome in AM and PM datasets.

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图1 分析Bmal1敲除转录组数据使用不同的参数,并重叠不同的数据集。

一种)对NESS-COHN中鉴定的节奏转录物(雨独立方法,FDR <0.1)的数量的比较分析。(1)和雷。(2)。所有的数据处理和分析参数在两个管道中是相同的,除了我们使用了不同的peak_border(0.1, 0.9),它提供了相对于Ness-Cohn略有不同(通常更低)的节奏转录本数量。(B.)检测到的节奏转录物的数量Bmal1- / -在37℃下成纤维细胞(2小时采样,日志2-转换的FPKM,雨,FDR < 0.1)。将参数与Ness-Cohn使用的参数进行比较。(他们的分析初始版本)和日志后的各种FPKM阈值2转型(雨纵型方法)。比较射线。参数[所有FPKM> 0,雨独立方法,Peak_Border(0.1,0.9)]显示。(C)在不同的节奏转录物(雨,FDR <0.1)中重叠Bmal1+/+(野生类型,wt)和Bmal1- / -MSF实验在37℃下进行。Bmal1- / -MSF数据集显示了大量的转录本(521/3790)节律性至少在四个数据集中的两个。(D.)节律转录本(RAIN, FDR < 0.1)在AM和PM数据集(间隔12小时,带内)的相位差分布Bmal1+/+Bmal1- / -成纤维细胞;在AM和PM数据集中的83节奏转录物表现出抗痉挛节奏Bmal1- / -无国界医生组织。(E.相反的阶段丰度剖面2在Ray中没有显示出的几个代表性节律基因。(雨,两个数据集中的FDR <0.1)。将来自三个生物重复的样品在每个时间点一起聚集在一起进行RNA-SEQ分析。(F)Limorhyde分析表明AM和PM数据集中的差异节律转录组。

在他们分析的最初版本中(见http://tiny.cc/gntutz.), Ness-Cohn。分析我们的数据,没有使用任何FPKM阈值。阈值化是RNA-seq数据分析中的一种标准做法,可以通过多种方法执行,包括去除含零的转录本或使用高于每个转录本平均表达水平的截断(如平均FPKM > 0.5) (4.)。在雷。(2),通过删除任何时间点上有零的文本来过滤数据。这与可以使用的各种平均FPKM阈值相当(图1 b) (1)。由于缺少这一标准的数据处理步骤,导致了所有奈斯-科恩基因中转录本数量的差异的初始分析(参见他们的代码http://tiny.cc/dntutz)。

Ness-Cohn。比较FDR调整P.使用秩相关的不同实验之间的值,并且他们建议由于数据集之间的相关性低,这表明再现低。该方法基于他们自己的工作,调查使用未校正的昼夜转录组数据集的不同节律性检测算法的再现性(例如,JTK_CYCLE雨)P.值(3.)。这种相关性度量没有被验证为研究之间的比较,也没有被验证为fdr调整后的比较P.值(而不是未校正的),这就是他们在此处使用的方式。此外,他们没有比较光线。与其他数据集的数据(即,通过其自身标准具有良好协调的数据集)。这很重要,因为存在大量的文献,表明基因组昼夜基因组数据集中的最小重叠(5.)。

我们不同意尼斯-科恩的观点在不同的37°C数据集中,转录本的数量是有节奏的。为了定义跨数据集的一致转录本,我们使用了另一种度量,要求一个转录本必须在至少两个数据集中有节奏。在我们的分析中,我们在4个数据集中的至少2个(RAIN FDR < 0.1)中确定了数百个转录本具有节律性(RAIN FDR < 0.1)。图1 c)。此外,我们希望澄清我们研究中描述的MSF昼夜转录组实验并未同时进行,而是在纸张的制备和修订过程中的不同阶段进行2至3年的时间框架。这也可能考虑一些可变性。

我们不同意作者的观察,只有很少的昼夜节律转录本表现出几乎相反的阶段Bmal1- / -MSF“AM”和“PM”数据集。再次,在对数据进行fpcm阈值化后,N.= 83个转录本(RAIN, FDR < 0.1)有较大的(9或12小时)相移Bmal1- / -MSF AM/PM数据集(图1 D和E)。我们还分析了AM和PM节律转录组数据集,使用LimoRhyde (6.)。该框架评估了两个基因组节奏数据集彼此不同的程度。LimorHyde表示AM和PM数据集之间的显着差异Bmal1- / -MSFS(FDR <0.1的438名成绩单)(图1 f)。

据我们所知,使用RNA-SEQ之前的温度补偿和/或相对夹带的分析尚未进行。因此,我们总是分析Bmal1+/+(即野生型)MSFs在每个实验中作为参考,并观察到的数据集之间的一致性水平与我们在Bmal1- / -细胞 (2)。因此,我们在NESS-COHN中看到没有理由的研究表明,有节奏的转录组在Bmal1- / -MSFs是“噪声”,当它被接受有振荡Bmal1+/+无国界医生组织。此外,他们并没有提供证据表明在相似的数据集实验中显示优越的再现性。

几个独立的证据表明,在没有的情况下证明了分子和代谢振荡Bmal17.8.)或另一种时钟敲除模型[加密色彩量不足的老鼠(9.),支持我们的观察。以确定在Bmal1- / -细胞是“噪音”而不是真正的昼夜节律,作者可以在他们认为完全没有外部提示的环境中进行相同的实验,以验证是否存在培养中绝对没有24小时分子振荡Bmal1- / -细胞在恒定条件下。

参考

致谢: 资助:A.B.R.承认来自宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院和宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院转化医学和治疗学研究所(ITMAT)的资助。作者的贡献:概念化和写作,a.b.r., s.r.和U.K.V.;所有作者对数据的解释达成一致,并批准稿件的最终版本;分析和可视化,a.b.r., s.r.和U.K.V.;融资收购,A.B.R.利益冲突:作者声明没有竞争利益。数据和材料可用性:RNA-seq数据可在基因表达Omnibus(登录号GSE111696和GSE134333)上获得。分析脚本可在GitHub (https://github.com/ReddysLab/Bmal1Paper)。

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