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回应关于“没有生物钟基因的昼夜节律”的评论BMAL1

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科学2021年4月16日:
第372卷,6539期,eabf1930
DOI: 10.1126 / science.abf1930

抽象的

ness-cohn.。声称我们在没有核心生物钟基因的情况下观察到的转录昼夜节律BMAL1小鼠皮肤成纤维细胞的证据不足。他们声称,他们无法通过重新分析重现一些最初的发现。我们不同意他们的分析和展望。

尼斯科恩在他们的评论中写道。(1)重新分析了我们纸张的一些内容,报告了皮肤成纤维细胞的转录组,蛋白质组和磷脂蛋白的24小时振荡和缺乏BMAL1(2)。作者着重研究了小鼠皮肤成纤维细胞(MSFs)中的转录组振荡。他们推测循环基因在BMAL1敲门声是由于“噪音”而不是昼夜振荡。但是,我们不同意他们的职位,并讨论所选参数如何影响分析。

Ray的数字如图1E所示。(2)反映作为温度补偿实验的一部分产生的37℃的节奏转录组数据的结果。在审查过程中,进行了这些额外的实验,并提供比初始实验更一致的结果,可能归因于37℃温度补偿实验中使用的更好(2小时)采样分辨率。此评论的作者将意识到此类采样解析效果,鉴于他们最近的主题(3.)。因此,根据这些数据更新循环转录物的数量,而在原始72小时的时间课程实验中绘制热图以进行相应的转录性曲线(以使其与肝组织时间课程的热图相当)。不幸的是,在修改论文期间,我们在传说中没有明确。对于这种混乱,我们深表歉意。

有节奏的抄本数量(897BMAL1- / -ness-cohn检测到的fdr <0.1)。在37°C数据集(2小时分辨率)中与我们检测到的数字非常相似[请参阅图1B中的条形图(1),也如图1E所示(2)。事实上,在他们和我们对任何MSF数据集的分析中(图1一个)。此外,在他们自己的分析中,尼斯-科恩。在另一个体内检测到成千上万的节奏转录本BMAL1FDR <0.1的淘汰数据集,包括AM和PM数据集2000年的节奏成分BMAL1敲门声[见图1B(1)]。我们不认为这么多有节奏的抄本可能是由“噪音”造成的。

Fig. 1 Analysis of Bmal1 knockout transcriptomics data using various parameters, and the overlap of the different datasets.

(A) Comparative analysis of the number of identified rhythmic transcripts (RAIN independent method, FDR < 0.1) in Ness-Cohn et al. (1) and Ray et al. (2). All the data processing and analysis parameters are the same in both pipelines, except that we used a different peak_border (0.1, 0.9), which provided a slightly different (usually lower) number of rhythmic transcripts relative to Ness-Cohn et al. (B) The number of rhythmic transcripts detected in Bmal1–/– fibroblasts at 37°C (2-hour sampling, log2-transformed FPKM, RAIN, FDR < 0.1). Parameters are compared to those used by Ness-Cohn et al. (initial version of their analysis) and various FPKM thresholds after log2 transformation (RAIN longitudinal method). Comparison to Ray et al. parameters [all FPKM > 0, RAIN independent method, peak_border (0.1, 0.9)] is shown. (C) Overlap among the rhythmic transcripts (RAIN, FDR < 0.1) identified in different Bmal1+/+ (wild type, WT) and Bmal1–/– MSF experiments performed at 37°C. Bmal1–/– MSF datasets show a substantial number of transcripts (521/3790) rhythmic in at least two of four datasets. (D) Phase difference distribution for the rhythmic transcripts (RAIN, FDR < 0.1) in AM and PM datasets (12 hours apart, entrained) for Bmal1+/+ and Bmal1–/– fibroblasts; 83 rhythmic transcripts in AM and PM datasets exhibited antiphase rhythms in Bmal1–/– MSFs. (E) Oppositely phased abundance profiles (log2 transformed FPKM) of a few representative rhythmic genes not shown in Ray et al. (RAIN, FDR < 0.1 in both datasets). Samples from three biological replicates were pooled together for RNA-seq analysis at each time point. (F) LimoRhyde analysis indicating differential rhythmic transcriptome in AM and PM datasets.

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图。1 分析BMAL1敲除转录组数据使用不同的参数,并重叠不同的数据集。

(一个)对比分析Ness-Cohn中识别的节律转录本数量(非RAIN方法,FDR < 0.1)。(1)和射线。(2)。所有的数据处理和分析参数在两个管道中是相同的,除了我们使用了不同的peak_border(0.1, 0.9),它提供了相对于Ness-Cohn略有不同(通常更低)的节奏转录本数量。(B中检测到的节律转录本数量BMAL1- / -37°C下成纤维细胞(2小时取样,记录2-转换的FPKM,雨,FDR < 0.1)。将参数与Ness-Cohn使用的参数进行比较。(他们分析的初始版本)和记录后的各种FPKM阈值2(RAIN纵向法)。比较雷。参数[所有FPKM > 0, RAIN独立方法,peak_border(0.1, 0.9)]显示。(C)不同节律转录本之间的重叠(RAIN, FDR < 0.1)BMAL1+ / +(野生型,WT)和BMAL1- / -MSF实验在37°C下进行。BMAL1- / -MSF数据集在四个数据集中的至少两个中显示了大量的转录物(521/3790)节奏。(D)节律转录本(RAIN, FDR < 0.1)在AM和PM数据集(间隔12小时,带内)的相位差分布BMAL1+ / +BMAL1- / -成纤维细胞;83个节律转录本在AM和PM数据集中表现出反相节律BMAL1- / -无国界医生组织。(E相反的阶段丰度剖面2在Ray中没有显示出的几个代表性节律基因。(RAIN, FDR在两个数据集中都小于0.1)。来自三个生物重复的样本在每个时间点汇集在一起进行RNA-seq分析。(F) LimoRhyde分析表明AM和PM数据中存在节律性转录组差异。

在他们分析的最初版本中(见http://tiny.cc/gntutz),ness-cohn。分析我们的数据,没有使用任何FPKM阈值。阈值化是RNA-seq数据分析中的一种标准做法,可以通过多种方法执行,包括去除含零的转录本或使用高于每个转录本平均表达水平的截断(如平均FPKM > 0.5) (4)。在雷。(2),通过删除任何时间点上有零的文本来过滤数据。这与可以使用的各种平均FPKM阈值相当(图1 b)(1)。没有这种标准的数据处理步骤导致所有NESS-COHN中所识别的转录物数量的差异。的初步分析(见他们的代码http://tiny.cc/dntutz.)。

ness-cohn.。FDR-adjusted相比P不同实验之间的值使用等级相关,他们表明,因为数据集之间的相关性低,这表明低重现性。该方法基于他们自己的工作,研究了使用未经校正的昼夜节律转录组数据集中不同节律性检测算法(如JTK_cycle和RAIN)的可重复性P值(3.)。这种相关性度量没有被验证为研究之间的比较,也没有被验证为fdr调整后的比较P值(与未修正的值相反),这就是他们在这里使用它的方式。同时,他们也没有比较Ray。与其他数据集的数据(即,通过其自身标准具有良好协调的数据集)。这很重要,因为存在大量的文献,表明基因组昼夜基因组数据集中的最小重叠(5)。

我们不同意尼斯-科恩的观点。关于不同37°C数据集之间有节奏的成绩单数量的担忧。为了在数据集中定义一致的转录物,我们使用了替代度量,要求转录物必须在至少两个数据集中成为节奏。在我们的分析中,我们将数百名转录物识别为节奏(雨FDR <0.1)在四个数据集中的至少两个(图1 c)。此外,我们希望澄清的是,本研究中描述的MSF昼夜转录组实验并不是同时进行的,而是在2- 3年的时间范围内,在论文的编写和修改过程中的不同阶段进行的。这也可以解释一些变异性。

我们不同意作者的观察,只有很少的昼夜节律转录本表现出几乎相反的阶段BMAL1- / -MSF“AM”和“PM”数据集。再次,在对数据进行fpcm阈值化后,n= 83个转录本(RAIN, FDR < 0.1)有较大的(9或12小时)相移BMAL1- / -MSF AM/PM数据集(图1,D和E)。我们还使用LimorHyde分析了AM和PM节奏转录组数据集(6)。该框架评估了两个基因组节奏数据集彼此不同的程度。LimorHyde表示AM和PM数据集之间的显着差异BMAL1- / -MSFs(438个转录本在FDR < 0.1) (图1 f)。

据我们所知,使用RNA-seq对温度补偿和/或相反的夹带进行分析之前从未进行过。因此,我们总是分析BMAL1+ / +(即,野生型)在每个实验中的MSFS作为参考,观察到与我们所观察到的数据集中的数据集之间的一致性水平BMAL1- / -细胞(2)。因此,我们在尼斯科恩身上看不到任何正当理由的研究表明,有节奏的转录组在BMAL1- / -MSFs是“噪声”,当它被接受有振荡BMAL1+ / +无国界医生组织。此外,它们不提供显示在类似数据集中实验上的卓越再现性的证据。

几个独立的证据线证明分子和代谢振荡缺乏BMAL1(7,8)或另一种时钟淘汰模型[隐花色素量不足的老鼠(9)],支持我们的观察。建立观察到的转录体级振荡BMAL1- / -细胞是“噪音”而不是真正的昼夜节律,作者可以在他们认为完全没有外部提示的环境中进行相同的实验,以验证是否存在培养中绝对没有24小时分子振荡BMAL1- / -细胞在恒定条件下。

参考

应答: 资金:A.B.R.承认来自宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院和宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院转化医学和治疗学研究所(ITMAT)的资助。作者的贡献:概念化和写作,a.b.r., s.r.和U.K.V.;所有作者对数据的解释达成一致,并批准稿件的最终版本;分析和可视化,a.b.r., s.r.和U.K.V.;融资收购,A.B.R.利益冲突:作者声明没有相互竞争的利益。数据和材料可用性:RNA-SEQ数据可在基因表达式OMNIBUS上获得(登录号GSE111696和GSE134333)。分析脚本可在github上使用(https://github.com/ReddysLab/Bmal1Paper)。

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