技术评论

评论“昼夜节律核心基因的节奏”Bmal1

查看全部隐藏作者和附属机构

科学2021年4月16日:
372卷,6539期,eabf0922
DOI: 10.1126 / science.abf0922

抽象的

射线。(报告,2020年2月14日,p. 800)最近声称温度补偿,自由运行的mRNA振荡Bmal1- / -肝脏切片和皮肤成纤维细胞。我们重新分析了这些数据,发现在这个基因型中可重复的mRNA振荡要少得多。我们还会注意错误和可能不适当的分析。

注:虽然本评论最初针对的是2020年2月14日发布的版本,但我们的要点也适用于2021年1月29日发布的勘误表和修订版本。

昼夜节日(〜24小时)时钟赋予了基本能力的生物,以相应地说明时间和调节行为和生理学(1)。BMAL1是驱动哺乳动物时钟的一组转录调节器之一,并且是节奏运动活动或节奏基因表达程序所必需的(2)。然而,雷。(3.)报道,Bmal1- / -小鼠肝脏切片和皮肤成纤维细胞展示了转录组的BONA FIDE自由运行的24小时昼夜昼夜昼夜振动,它们被解释为新颖的签名Bmal1- 依赖性,细胞 - 自主分子振荡器。

覆核原始资料(3.)透露野生型和Bmal1- / -切换肝脏数据集。虽然此错误现已纠正,但几个键Bmal1- / -因此,最初描述的结果是野生型切片。尽管出现了这种修正,但事实确实如此Bmal1- / -切片振荡总体是低幅度,最有可能的艺术起源。小鼠皮肤成纤维细胞(MSF)数据显示出类似的趋势。因此,在一起的数据仍然不支持aBmal1- 依赖性,细胞内源性分子振荡器。

我们最初绘制了来自Geo上提供的FPKM表的核心时钟成绩单(图1一个);直接和间接BMA1目标的水平与规范和公开的结果不相容Bmal1- / -4.)。例如,NR1D1含量是高的而不是低的,然而cry1.水平低于高(图1一个)。测序结果表明,GEO原始数据基因型标签正确Bmal1- / -样本包括定位于新霉素耐药基因(图1 b),删除的外显子是显而易见的。因此,在2020发布的纸张中使用逆转基因型是明确的[图3C,图S2,C和D,以及(3.));关于Bmal1- / -肝脏切片涉及野生类型,反之亦然。

Fig. 1 Reanalysis of raw data in wild-type and Bmal1–/– liver slices reveals inverted genotypes and absence of robust high-amplitude rhythms.

(A) Transcript levels (log2 FPKM) of Nr1d1 and Cry1 are shown from the original FPKM table in wild-type (blue) and Bmal1–/– (red) liver slices. (B) Only Bmal1–/– (KO) GEO samples show raw sequencing reads mapping to the neomycin cassette. However, the original FPKM table contained inverted genotype labels. (C) Transcript levels (log2 CPM) of Nr1d1 and Cry1 after remapping and quantification of the GEO raw data. Genotypes are inverted relative to (A). (D) Transcript levels of Per1 and Arntl genes are shown for the wild type (blue) and Bmal1–/– (red) after reassigning correct genotypes. (E) With correct genotypes, 24-hour rhythmicity as detected by JTK is higher in the KO than in the wild type (WT). No genes pass q < 0.05 in WT. (F) The oscillatory amplitudes of the detected rhythms (P < 0.05) are a factor of <2 [unlike figure S3A of (3)]. (G) The corresponding gene patterns are strongly correlated, showing two anticorrelated groups of genes (k-means clustering with two centroids). Data were filtered before analysis to remove genes with a mean expression of <3 FPKM, or with more than six (24-sample datasets) or four (16-sample datasets) zero values. Data were log2-transformed. For simplicity, because this was sufficient to make our points, we used one of the rhythmicity methods used in (3), JTK-cycle, with the following parameters: 24-hour period, P < 0.05. Genome-wide q-value correction was done with the BH method (9). Amplitude was calculated using JTK-cycle.

" data-icon-position="" data-hide-link-title="0">
图1 在野生型和野生类型中的原始数据分析Bmal1- / -肝切片显示倒置基因型和缺乏强健的高振幅节律。

一种)转录水平(日志2FPKM)的NR1D1cry1.从原始FPKM表中显示出野生型(蓝色)和Bmal1- / -(红色)肝脏切片。(B.)只Bmal1- / -(KO) GEO样本显示与新霉素盒对应的原始测序reads。然而,原来的FPKM表包含了倒置基因型标签。(C)转录水平(日志2CPM)的NR1D1cry1.重新映射和定量地理原始数据之后。基因型相对于(a)倒置。(D.)转录水平Per1Arntl基因显示为野生型(蓝色)和Bmal1- / -(红色)重新分配正确的基因型后。(E.)具有正确的基因型,JTK检测到的24小时节奏性比野生型(WT)更高。没有基因通过问:WT < 0.05 . (F)检测到的节奏的振荡幅度(P.< 0.05)是<2的因数[不像图S3A (3.)]。(G)对应的基因模式具有很强的相关性,显示出两组与抗腐蚀相关的基因(k-means聚类为两个中心)。在分析前对数据进行过滤,去除平均表达<3 FPKM的基因,或去除超过6个(24个样本数据集)或4个(16个样本数据集)零值的基因。数据日志2改变了。为了简单起见,因为这足以说明我们的观点,我们使用了(3.),JTK周期,具有以下参数:24小时,P.<0.05。基因组 -问:- 使用BH方法进行校正(9.)。使用JTK周期计算幅度。

虽然核心时钟转录本的平均水平现在在正确分配中出现正确Bmal1- / -图1 c),它们的时间模式很奇怪。例如,Bmal1只有在野生类型的节奏应该是有节奏,但在两个基因型中显示出非常相似和弱弱节奏的模式(图1 d)。同样令人惊讶的是,大多数其他的时钟转录本在野生型中没有显示出节律,但显示出24小时的波动Bmal1- / -图1 d)。此外,这些时钟转录物波动在该缺失基因型中类似时间显示峰值或尖峰,这表明这些波动不是由残余核心时钟电路相互作用驱动的Bmal1- / -。野生型样品中缺乏节奏也表明在肝脏实验中有技术上存在缺陷。

此外,全基因组24小时周期现在显著地高于(真实的)Bmal1- / -样本比野生型样本(例如,没有野生型基因通过问:< 0.05 JTK filter) (图1 e)。用一个更轻松的过滤器(P.然而,<0.05),两种基因型中的所有振荡幅度都低(因子<2;图1 f),而不像图S3A中(3.)。令人惊讶的是,这些弱节奏波动都是相关的,并且只有两种基因型中的两种逆相关模式[图1克;与图S2,C和D的比较(3.)清楚地说明了基因型反转]。通过在地塞米松的单一启动脉冲之后缺乏逐渐振幅阻尼,缺乏对内部振荡器的唯一依赖性也被缺失。野生型振幅甚至在第三天大幅增加,在启动脉冲后近5天(图1克)。

这些考虑表明,肝切片的波动可能受到外部因素的影响,甚至是由外部因素引起的,例如介质变化或其他非预期的日常干预。识别ETS因素作为野生型和野生型的可能驱动因素Bmal1- / -因此,节律可能反映了这些外部原因,尽管这些因素之前已经与日间转录节奏(5.6.)。

射线。还提供了12个MSFs数据集,6个野生型和6个Bmal1- / -: MSF数据集[37°C;图2 (E, F)3.), 3个温度数据集[分别在27℃、32℃和37℃各有一个数据集;图2从A到D3.)],一个AM数据集[37℃;图2 (E, F)3.),以及PM数据集[37℃;图2 (E, F)3.)]。所有细胞与地塞米松同步,AM和PM同步偏移12小时。

在方法部分中没有转录振荡标准(3.)妨碍我们尝试说明这些数据集的自行车属性。因此,我们选择设置我们的标准,使得循环成绩单的数量相似但略微少于报道[图S1c(3.));因此,我们的JTK标准可能与(3.)。尽管如此,节奏转录物的数量在每个数据集中广泛变化(图2一个)。此外,他们几乎所有(98.4%)的振幅都很低,小于0.5(对数)2),符合更严格且经常使用的标准的不到5%问:<0.05标准(基因组宽Benjamini-Hochberg)。

图2 Bmal1- / -小鼠成纤维细胞,很少有基因具有一致的节律性,并表现出自由运行和温度补偿节律。

一种)四分之一的节奏转录物Bmal1- / -MSF实验在37°C下进行。在四个数据集中,只有38个基因具有节律性。(B.)对来自(A)的38个基因在27°、32°和37°C的数据集中进行了检测。这38个基因中只有16个在所有温度下都有节律性,因此很可能是温度补偿的。(C)研究了来自(B)的16个温度补偿的始终节奏基因的基因表达模式Bmal1- / -AM(蓝色)或PM(黄色)数据集。在两个数据集中,有7个基因具有节律性;然而,只有一个显示反相位的AM/PM节律,这仅限于第一天。基因表达用FPKM (log .)表示2)。时间(CT)显示在X轴。(D.)大多数温度补偿,Bmal1- / -节奏基因在至少一个野生型数据集中也是节奏的。数据预处理和节律性分析如所述图1。缺口分析是用毛绒进行的(10)。在图1和图2中,我们没有分析非24小时周期或其他时间模式。

我们仔细检查了这四个人的循环记录Bmal1- / -在类似条件下收集的数据集,即37°C培养的MSFs: MSF、AM、PM、37。这些节律性转录本的重叠很小(图2一个),因为大多数基因只出现在四个数据集中的一个,而只有38个基因(约1%)至少出现在四个数据集中的三个。值得注意的是,在(3.)在38个节律一致基因中[图2,E和F, of (3.)]。在这种情况下,该循环算法不能解释这种低重叠,因为在这种情况下,由于基因表达的简单绘制也揭示了样品中缺乏一致性。在野生型数据中有相当的缺乏可重复性;只有59个基因(1.1%)是四个野生型数据集中的三种。

我们测试了38是否始终如一的节奏Bmal1- / -在27℃下的转录物也在27℃和32℃下鉴定。38个转录物中的16个标准符合该标准,或42%(图2 b),表明这16个振荡转录物确实可以是温度补偿的。

我们在AM/PM数据集中更详细地检查了这16个转录本。只有7个是有节奏的(图2 c),其中只有一个仅通过地塞米松与振荡器同步的预期反相模式。此外,这种模式仅在第一天可见。几乎所有其他六种节奏的转录物都在AM / PM数据集中展示了类似的中午阶段,这表明这些节奏可能是外部驱动而不是自由运行。

虽然它是暗示的Bmal1- / -节奏转录物特异于此基因型(3.),我们在野生型循环数据(图2 d)。即使是六个素数Bmal1-独立温度补偿循环器[图2D (3.)]在至少一个野生型数据集中也是节奏的。

总之,大多数Bmal1- / -MSF节奏转录物的幅度低,显着性低,数据集的一致性很小;值得注意的是,在修订版的版本中,MSF节奏转录物不变。尽管如此,可能存在少数Bmal1- / -符合节奏标准的转录本。然而,它们并不是令人信服地自由运行。值得注意的是,即使重新分配基因型后,野生型肝切片数据中也没有核心时钟转录本振荡,而其中一些显示出周期性但非典型的阶段性模式Bmal1- / -。此外,不同于以前的肝切片振荡(7.8.),没有观察到阻尼。因此,我们的分析反驳了aBmal1-独立和细胞自主振荡器。

数据来源:需要注意的是,在2020年8月27日将原稿发送给作者后,GEO (GSE111696)上的处理数据文件于2020年9月11日进行了更新,并更正了基因型分配。

参考

致谢:我们感谢J. Hogeresch和R. Braun分享他们对肝脏切片和成纤维细胞数据集的独立分析。资助:mr .和kca是由霍华德·休斯医学研究所资助的。Naef实验室的研究得到了瑞士国家科学基金310030_173079和EPFL的资助。作者的贡献:构思与写作,kc.a., c.g., F.N, M.R.;形式化分析与形象化,kca和C.G.;资金收购,f.n和mr利益冲突:没有任何。数据和材料可用性:原始和更新的数据集(3.)可以提供补充分析和脚本https://github.com/naef-lab/ray_science_2020_reanalysis.

保持联系,科学

主题

导航本文