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对“没有生物钟基因的昼夜节律”的评论BMAL1

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科学2021年4月16日:
372卷,6539期,eabf0922
DOI:10.1126 / science.abf0922

摘要

射线。(报告,2020年2月14日,p. 800)最近声称温度补偿,自由运行的mRNA振荡BMAL1- / -肝脏切片和皮肤成纤维细胞。我们重新分析了这些数据,发现在这个基因型中可重复的mRNA振荡要少得多。我们还会注意错误和可能不适当的分析。

注意:虽然此评论最初讨论了2020年2月14日发布的版本,但我们的重点也适用于2010年1月29日发布的勘误和修订。

昼夜节律(~24小时)时钟赋予生物体基本的时间能力,并相应地调节行为和生理(1)。BMAL1是驱动哺乳动物时钟的一组转录调节器之一,并且是节奏运动活动或节奏基因表达程序所必需的(2)。但是,雷。(3.)报道,BMAL1- / -小鼠肝脏切片和皮肤成纤维细胞展示了转录组的BONA FIDE自由运行的24小时昼夜昼夜昼夜振动,它们被解释为新颖的签名BMAL1- 依赖性,细胞 - 自主分子振荡器。

覆核原始资料(3.)透露野生型和BMAL1- / -肝脏数据集被切换。虽然这个错误现在已经纠正,几个关键BMAL1- / -因此,最初描述的结果是野生型切片。尽管出现了这种修正,但事实确实如此BMAL1- / -切片振荡总体是低幅度,最有可能的艺术起源。小鼠皮肤成纤维细胞(MSF)数据显示出类似的趋势。因此,在一起的数据仍然不支持aBMAL1- 依赖性,细胞内源性分子振荡器。

我们最初绘制了来自Geo上提供的FPKM表的核心时钟成绩单(图。1A);直接和间接BMA1目标的水平与规范和公开的结果不相容BMAL1- / -4.)。例如,Nr1d1含量是高的而不是低的,然而Cry1水平低于高(图。1A)。阅读的重新映射显示Geo原始数据基因型标签是正确的:BMAL1- / -样品包括读取到新霉素抗性基因的映射(图。1B),删除的外显子是显而易见的。因此,在2020发布的纸张中使用逆转基因型是明确的[图3C,图S2,C和D,以及(3.));关于BMAL1- / -肝脏切片涉及野生类型,反之亦然。

Fig. 1 Reanalysis of raw data in wild-type and Bmal1–/– liver slices reveals inverted genotypes and absence of robust high-amplitude rhythms.

(A) Transcript levels (log2 FPKM) of Nr1d1 and Cry1 are shown from the original FPKM table in wild-type (blue) and Bmal1–/– (red) liver slices. (B) Only Bmal1–/– (KO) GEO samples show raw sequencing reads mapping to the neomycin cassette. However, the original FPKM table contained inverted genotype labels. (C) Transcript levels (log2 CPM) of Nr1d1 and Cry1 after remapping and quantification of the GEO raw data. Genotypes are inverted relative to (A). (D) Transcript levels of Per1 and Arntl genes are shown for the wild type (blue) and Bmal1–/– (red) after reassigning correct genotypes. (E) With correct genotypes, 24-hour rhythmicity as detected by JTK is higher in the KO than in the wild type (WT). No genes pass q < 0.05 in WT. (F) The oscillatory amplitudes of the detected rhythms (P < 0.05) are a factor of <2 [unlike figure S3A of (3)]. (G) The corresponding gene patterns are strongly correlated, showing two anticorrelated groups of genes (k-means clustering with two centroids). Data were filtered before analysis to remove genes with a mean expression of <3 FPKM, or with more than six (24-sample datasets) or four (16-sample datasets) zero values. Data were log2-transformed. For simplicity, because this was sufficient to make our points, we used one of the rhythmicity methods used in (3), JTK-cycle, with the following parameters: 24-hour period, P < 0.05. Genome-wide q-value correction was done with the BH method (9). Amplitude was calculated using JTK-cycle.

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图。1 在野生型和野生类型中的原始数据分析BMAL1- / -肝切片揭示了倒置基因型和没有稳健的高幅度节律。

一种)记录级别(日志2FPKM)的Nr1d1Cry1原始FPKM表中显示的野生型(蓝色)和BMAL1- / -(红色)肝脏切片。(B.) 仅有的BMAL1- / -(KO) GEO样本显示与新霉素盒对应的原始测序reads。然而,原来的FPKM表包含了倒置基因型标签。(C)记录级别(日志2CPM)Nr1d1Cry1重新映射和定量地理原始数据之后。基因型相对于(a)倒置。(D.)成绩单水平PER1ARNTL.基因显示为野生型(蓝色)和BMAL1- / -(红色)重新分配正确的基因型后。(E.)具有正确的基因型,JTK检测到的24小时节奏性比野生型(WT)更高。没有基因通过问:WT < 0.05 . (F)检测到的节奏的振荡幅度(P.< 0.05)是<2的因数[不像图S3A (3.)]。(G)相应的基因图案具有强烈相关,显示出两组逆相关基因(K-Means聚类与两个质心)。在分析之前过滤数据以除去具有<3 FPKM的平均表达的基因,或者具有超过六个(24样品数据集)或四(16样品数据集)零值。数据是日志2改变了。为了简单起见,因为这足以说明我们的观点,我们使用了(3.)、JTK-cycle,参数如下:24小时周期、P.< 0.05。全基因组问:- 使用BH方法进行校正(9.)。使用JTK周期计算幅度。

虽然核心时钟转录本的平均水平现在在正确分配中出现正确BMAL1- / -图1C.),他们的时间模式很奇怪。例如,BMAL1只在野生型中具有节律性,但在两种基因型中都表现出非常相似且节律性较弱的模式(图。1D)。同样令人惊讶的是,大多数其他的时钟转录本在野生型中没有显示出节律,但显示出24小时的波动BMAL1- / -图。1D)。此外,在该缺失基因型中,这些时钟转录本的波动在相似的时间出现峰值或峰值,这表明这些波动不是由在该缺失基因型中残留的核心时钟电路相互作用驱动的BMAL1- / -。野生型样品中缺乏节奏也表明在肝脏实验中有技术上存在缺陷。

此外,在(真实)中,基因组的24小时周期现在令人惊叹更高BMAL1- / -比在野生型样品中的样品(例如,没有野生型基因通过问:< 0.05 JTK filter) (图1E.)。用一个更轻松的过滤器(P.然而,<0.05),两种基因型中的所有振荡幅度都低(因子<2;图。1F.),而不像图S3A中(3.)。令人惊讶的是,这些弱节奏波动都是相关的,并且只有两种基因型中的两种逆相关模式[图1G.;与图S2,C和D的比较(3.)清楚地说明了基因型反转]。通过在地塞米松的单一启动脉冲之后缺乏逐渐振幅阻尼,缺乏对内部振荡器的唯一依赖性也被缺失。野生型振幅甚至在第三天大幅增加,在启动脉冲后近5天(图1G.)。

这些考虑表明,肝脏切片波动可能受到影响,甚至是外部 - 例如,媒体变化或其他意外的日常干预措施。作为野生类型的可能驱动器的识别ETS因子BMAL1- / -因此,即使这些因素以前与昼夜转录节奏相关(),节律也可以反映这种外部原因(5.6.)。

射线。还提供了12个MSFs数据集,6个野生型和6个BMAL1- / -:MSF数据集[37°C;图2,e和f,的(3.), 3个温度数据集[分别在27℃、32℃和37℃各有一个数据集;图2从A到D3.)],AM数据集[37°C;图2,e和f,的(3.)]和PM数据集[37°C;图2,e和f,的(3.)]。将所有细胞与地塞米松同步,AM和PM同步偏移12小时。

(方法部分缺少抄本振荡标准)3.)阻碍了我们阐明这些数据集的循环特性。因此,我们选择设定我们的标准,使循环转录本的数量相似,但比报道的要少一些[图S1C (3.));因此,我们的JTK标准可能比使用的相似或略微严格(3.)。尽管如此,在每个数据集中节奏转录本的数量差异很大(图2A)。此外,他们几乎所有(98.4%)的振幅都很低,小于0.5(对数)2),小于5%遇到更严格并经常使用问:< 0.05标准(全基因组benjamin - hochberg)。

图2 BMAL1- / -小鼠成纤维细胞,很少有基因具有一致的节律性,并表现出自由运行和温度补偿节律。

一种)四分之一的节奏转录物BMAL1- / -MSF实验在37℃下进行。只有38个基因在四个数据集中的三个中有节奏。(B.)对来自(A)的38个基因在27°、32°和37°C的数据集中进行了检测。这38个基因中只有16个在所有温度下都有节律性,因此很可能是温度补偿的。(C)研究了来自(B)的16个温度补偿的始终节奏基因的基因表达模式BMAL1- / -am(蓝色)或PM(黄色)数据集。两个基因在两个数据集中是有节奏的;然而,只有一个显示抗磷酶AM / PM节奏,这限于第1天1.基因表达式表示为FPKM(日志2)。时间(CT)显示在X轴。(D.)大多数温度补偿,BMAL1- / -节奏基因在至少一个野生型数据集中也是节奏的。数据预处理和节律性分析如所述图。1。采用UpsetR (10)。在图1和图2中,我们没有分析非24小时周期或其他时间模式。

我们仔细检查了这四个人的循环记录BMAL1- / -在类似条件下收集的数据集,即37°C培养的MSFs: MSF、AM、PM、37。这些节律性转录本的重叠很小(图2A),大多数是只有四个数据集中的一个,而只有38个基因(〜1%)在四个数据集中的至少三个。值得注意的是,11个基因中只有1个突出显示(3.)在这些38中始终如一的节奏基因[图2,E和F,(3.)]。这种低重叠不能用一种特定的循环算法(在本例中是JTK)来解释,因为一个简单的基因表达图也揭示了样本中缺乏一致性。野生型数据的再现性相对较差;只有59个基因(1.1%)在四个野生型数据集中的3个。

我们测试了38是否始终如一的节奏BMAL1- / -37°C的转录本在27°C和32°C也被鉴定。38个转录本中有16个符合这一标准,即42% (图。2B),表明这16个振荡转录物确实可以是温度补偿的。

我们在AM/PM数据集中更详细地检查了这16个转录本。只有7个是有节奏的(图2C.),其中只有1例在间隔12小时使用地塞米松振荡器同步后出现了预期的反相模式;此外,这种模式只在第一天可见。在AM/PM数据集中,几乎所有其他六个节律转录本都显示出类似的上午十点左右的阶段,这表明这些节律可能是外部驱动的,而不是自由运行的。

虽然它是暗示的BMAL1- / -节奏转录本对于这种基因型是特定的(3.),我们在野生型循环数据(图2D)。即使是六个素数BMAL1-独立温度补偿循环器[图2D (3.)]在至少一个野生型数据集中也是有节奏的。

总之,大多数BMAL1- / -MSF节奏转录物的幅度低,显着性低,数据集的一致性很小;值得注意的是,在修订版的版本中,MSF节奏转录物不变。尽管如此,可能存在少数BMAL1- / -符合节奏标准的转录物。然而,他们并不是令人信服的自由运行。也非常值得注意的是,即使在重新分配基因型之后,野生型肝脏分层数据中没有核心时钟转录振荡也没有核心时钟转录振荡,而其中一些在其上显示出周期性但有非典型的模式BMAL1- / -。此外,不同于以前的肝切片振荡(7.8.),没有观察到阻尼。因此,我们的分析旨在反对a的索赔BMAL1- 依赖和细胞自主振荡器。

数据来源:需要注意的是,在2020年8月27日将原稿发送给作者后,GEO (GSE111696)上的处理数据文件于2020年9月11日进行了更新,并更正了基因型分配。

参考文献

致谢:我们感谢J. Hogenesch和R. Braun分享他们对肝切片和成纤维细胞数据集的独立分析。资金:mr .和kca是由霍华德·休斯医学研究所资助的。Naef实验室的研究得到了瑞士国家科学基金310030_173079和EPFL的资助。作者捐款:概念化和写作,K.C.A.,C.G.,F.N.和M.R;正式分析和可视化,K.C.A.和c.g;资金收购,F.N.和m.r.利益冲突:一个也没有。数据和材料可用性:来自(3.)可以提供补充分析和脚本https://github.com/naef-lab/ray_science_2020_reanalysis.

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