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评论“昼夜节律核心基因的节奏”Bmal1

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科学2021年4月16日:
卷。372,问题6539,EABE9230
DOI:10.1126 / science.abe9230

抽象的

射线。(报告,2020年2月14日,p. 800)在缺乏核心时钟组件BMAL1的小鼠组织中报告了明显的转录昼夜节律。为了更好地理解这些令人惊讶的结果,我们重新分析了相关数据。我们无法重现最初的发现,也无法确定可靠的循环基因。我们的结论是,没有足够的证据支持昼夜节律在缺乏Bmal1

最近,雷。(1)报告了缺乏BMA11的小鼠组织中的转录节律性。BMAL1是昼夜节环分子振荡器的核心部件(2)其缺失与生理和分子节律的丧失有关(3.)。因此转录昼夜节律是意料之外的Bmal1- / -敲门声。

几个实验描述于(1)使用小鼠皮肤成纤维细胞Bmal1- / -与地塞米松(DEX)同步后敲除和野生型小鼠,包括:

(i)鉴定循环基因,样品在37℃下每3小时72小时,在DEX后48小时开始;

(ii)温度补偿调查,从DEX后48小时开始,在27°、32°或37°C下连续48小时,每2小时取一次样品;

(iii)AM / PM相移实验,用样品每3小时在37°C时48小时,开始48小时(“AM”)和60小时(“PM”)。

RNA测序数据在Geo(GSE111696,GSE134333)上公开可用,作为原始数据和加工FPKM(每千次映射读取的每千次映射的碎片)值。

这三个实验中的常见条件(在DEX后37°C,48小时)提供了测试是否可以可重复地检测到循环转录物的机会。额外的一致性检查来自实验III,其中我们预计这两种情况会揭示一组常见的循环基因,相移12小时。应可靠地检测到真正的昼夜控制下的基因作为这些实验的循环。

我们在这些实验中检测了节奏基因的可重复性。因为有统计学意义的循环记录列表没有公布,我们重新分析了Ray使用作者声明的协议:“通过删除任何时间点FPKM值为零的文本来过滤数据,然后将FPKM值进行log2转换……RAIN(默认模式,独立方法)[(4.)]用于检测节奏转录物。。。使用以下参数:句点= 24小时,句点= 0或6,FDR <0.1或P-值<0.05“(15.)。RAIN的基因内调整采用默认的ABH方法(4.),其次是Benjamini-Hochberg FDR(虚假发现率)在多种基因上调整(6.)。

我们以三种方式分析了结果。将循环成绩单的数量与报告的人进行了比较了(1)。我们将循环统计数据与三个实验进行了比较,以研究骑车者的再现性。最后,我们测试了实验III中的循环基因是否表现出预期的相移。

我们的分析未能重现(1)。我们在实验中确定了较少的循环成绩单,而不是报道(1)[图1一个;比较图1f(1)]。例如,我们发现185个基因,FDR <0.1Bmal1- / -与在(1)。虽然有一些关于他们的方法的歧义,但没有合理的参数选择再现他们的计数。因为我们的分析使用已发布的FPKM值,所以我们的分析与(1)不能归因于排列的差异。

Fig. 1 Reanalysis of transcriptional cycling in Bmal1+/+ and Bmal1–/– mouse skin fibroblast cells across three experiments performed by Ray et al.

(A) Genes detected as cycling in mouse skin fibroblasts at various significance levels for experiment i. P values were adjusted for multiple waveform tests using the ABH method of RAIN, followed by FDR correction across the multiplicity of genes. Relative to the values reported in figure 1E of (1), we identify far fewer cycling transcripts in both the wild type and the Bmal1–/– knockout. (B) Upset plot showing overlap in genes detected as cycling at FDR < 0.1 in all arms of experiments i to iii; blue and green bars indicate wild type and Bmal1–/–, respectively. Darker bars indicate the common 37°C, 48 hours post-DEX control condition; lighter bars indicate the experimental conditions (27° and 32°C in experiment ii; PM in experiment iii). The minimum set overlap is truncated at 25 for readability. Note that most genes detected as cycling are unique to a particular dataset and not reproduced by others. Inset: Untruncated upset plot for the common 37°C, 48 hours post-DEX control condition. (Overlaps between control arms may include genes that also overlap in non–control arms, shown in the main plot.) Note again that few genes are detected reproducibly among all three datasets despite the common conditions. Upper right: Scatterplots (upper triangle), histograms (diagonal), and rank correlation coefficients of FDR-adjusted P values for the common genes in the 37°C condition of the three experiments. Red lines in the upper triangle indicate FDR = 0.1, with points displayed on a –log10 scale; genes above the lines on this plot have FDR < 0.1. In the lower triangle, conditional probabilities of having FDR < 0.1 along the y axis given FDR < 0.1 along the x axis (and vice versa) are also shown. (C) Relationship among AM FDR, PM FDR, and AM-PM phase difference in experiment iii. Significant genes at FDR < 0.1 lie above 1 on the –log10 scale; the most significant cyclers lie close to the upper right corner. Highly significant genes tend to have large phase differences in Bmal1+/+; this is not observed in Bmal1–/–.

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图1 转录循环的再分析Bmal1+ / +Bmal1- / -小鼠皮肤成纤维细胞横跨射线进行的三个实验

一种)在各种意义水平的实验I处于小鼠皮肤成纤维细胞中检测到循环的基因。P.使用ABH雨水法调整值的多个波形试验,然后通过基因的多种基因进行FDR校正。相对于图1E中报告的值(1),我们在野生类型和野生类型中识别较少的循环转录物Bmal1- / -昏死。(B.)在实验I至III的所有武器中,显示为在FDR <0.1的循环中检测到的基因重叠的镦粗图。蓝色和绿色棒表示野生类型和Bmal1- / -, 分别。较暗的杆表示常见的37°C,后48小时后控制条件;更轻的条形表示实验条件(实验II中的27°和32°C; PM在实验III中)。最小集重叠在25处被截断以进行可读性。请注意,作为循环检测到的大多数基因对于特定数据集是独一无二的,而不是由他人再现。插入:常见的37°C,48小时后48小时的unrtrungated镦粗图。(控制臂之间的重叠可以包括在主图中示出的非控制臂中也重叠的基因。)再次注意,尽管常见的条件,但是在所有三个数据集中可重复地检测到很少的基因。右上角:散点图(上三角形),直方图(对角线),以及FDR调整的等级相关系数P.在三个实验的37°C条件下,对常见基因的值。上面三角形中的红线表示FDR = 0.1,点显示在-log上10.规模;在该图中的线上的基因具有FDR <0.1。在较低的三角形中,沿着沿着FDR <0.1的条件概率y轴给出FDR <0.1沿着X还显示了轴(反之亦然)。(C)在实验III中的AM FDR,PM FDR和AM-PM相位差之间的关系。FDR <0.1的重要基因在-LOG上以上110.规模;最重要的自行车位于靠近右上角的位置。高度显著的基因往往有很大的相位差异Bmal1+ / +;这没有观察到Bmal1- / -

3个实验都有一个共同的控制条件(持续黑暗,37℃,DEX处理48小时后开始采样),只是采样的长度和频率不同。虽然采样选择会对循环检测产生影响,但三个实验中的采样方案性能相当(7.)。因此,在所有三个实验中应可重复地检测到昼夜昼夜控制下的基因。然而,在所有三个实验中循环,很少有什么基因被循环:野生类型中只有26个转录物和四个转录物Bmal1- / -通过fdr <0.1(图1 b),其中只有一个是注释基因(Clk4)。这表明绝大多数“有节奏的”转录本缺乏可重复性。如果探测在另一个数据集中是有节奏的(FDR < 0.1),那么结果的重叠可以通过条件概率进一步量化。8.)。完美的重现性是1,而重现性不会比概率好到0.1。观察到的条件概率很低,从0.01到0.3,中位数为0.12(近似概率)。我们还发现,fdr调整后的变量之间的等级相关性较低P.值暗示一个实验中的高度排名的骑车者通常在其他实验中通常不受排名。在两者中都观察到这种不可递容的性能Bmal1- / -敲除和野生类型;值得注意的是,野生型和Bmal1- / -P.值在基因型中没有比跨越基因型(图1 b,插图)。

在实验III中,我们期望在AM和PM条件下检测昼夜昼夜基因,尽管相移(反射早期的DEX脉冲)。虽然雷。显示“代表性”节奏基因显示相移[图2,F和G,的(1)],未见系统分析报告。我们计算了AM和PM中FDR < 0.1和FDR < 0.05的基因数量,以及它们的相位差(表1图1 c)。尽管期望这些应该是一致的,但是对于任何基因型之间的am和pm之间的节奏差异相对较少。在AM和PM的FDR <0.1循环中检测到的基因,大多数呈现比预期更小的相差Bmal1- / -表1)。在FDR < 0.05时,这种效应更加明显,在此情况下,强周期者倾向于具有预期的较大的相位差Bmal1+ / +但不是在Bmal1- / -表1图1 c)。这表明观察到的振动Bmal1- / -不通过DEX脉冲同步。

表1 AM与PM条件的分布在AM和PM条件下在FDR <0.1(无括号)和FDR <0.05(括号)下显着循环的基因的差异。

在两个基因型中,基因在循环的情况下,基因循环的条件概率与FDR <0.1的循环循环循环,在两个基因型中均小于0.2,在AM和AM之间通常在循环基因中的重叠相对较少。下午。大多数强循环仪在野生型中表现出预期的大相差,但相差小Bmal1- / -(FDR <0.05基因之间的中值相差是野生型9小时,而3小时Bmal1- / -)。分布之间的分配显着差异Bmal1+ / +Bmal1- / -,阶段Bmal1+ / +高于in.Bmal1- / -P.<0.0001,Fisher的确切测试)。

把这个表:

请注意,原始版本(1)表示使用雨“纵向”方法,并未提及基因的过滤;这是后来更新的(5.)。可以在我们的代码存储库中找到使用原始设置的结果;虽然输出不同,但关键发现​​(缺乏再现性和内部一致性)不变。

我们的分析表明,在任何给定的研究中检测到作为“循环”的各种基因可能是误报(7.8.)或实验伪影。大多数节奏基因不是可重复的循环的事实与之前的观察结果一致,雨水具有高假阳性率(7.8.);但是,我们观察了使用JTK_CYCLE(9.)及电脑辅助系统(10.)。与环境的相互作用或细胞之间的相互作用(11.)。虽然我们不能排除可能有昼夜动态的可能性Bmal1- / -,我们在这些数据中没有发现任何证据表明昼夜节律是一致的。

参考

致谢:我们感谢M. Rosbash和J. Hogeresch分享他们对光线数据集的独立分析,以及审阅者的有用评论。资助:NSF授予1764421和Simons基金会授予597491-RWC作为NSF-SIMONS的一部分,是西北大学的NSF-SIMONS。作者的贡献:E.N.C. R.A.和R.B.构思了这项研究;e。n。c。和r。b。进行了分析。所有作者对手稿都有贡献。利益争夺:没有任何。数据和材料可用性:从Geo(GSE111696,GSE134333)获得数据。R码重现我们的结果(以及附加分析)可从https://bitbucket.org/biocomplexity/bmal1techcomment

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