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对“没有生物钟基因的昼夜节律”的评论BMAL1

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科学2021年4月16日:
卷。372,问题6539,EABE9230
DOI: 10.1126 / science.abe9230

摘要

射线。(报告,2012年2月14日,第800页)报告缺乏核心时钟元件BMA1的小鼠组织中明显转录昼夜节律。为了更好地了解这些令人惊讶的结果,我们重新分析了相关数据。我们无法重现原始调查结果,也无法识别可靠的循环基因。我们得出结论,没有足够的证据来支持昼夜转录节奏在没有BMAL1

最近,雷。(1)报告了缺乏BMAL1的小鼠组织的转录节律性。BMAL1是昼夜节律分子振荡器(2),其缺失与生理和分子节律的丧失有关(3.)。因此,转录的昼夜节奏是意外的BMAL1- / -淘汰赛。

几个实验描述于(1)使用小鼠皮肤成纤维细胞BMAL1- / -与地塞米松(DEX)同步后的基因敲除和野生型小鼠,包括:

(i)鉴定循环基因,样品在37℃下每3小时72小时,在DEX后48小时开始;

(ii)温度补偿调查,在德克索后48小时开始48小时,在27°,32°或37°C下进行48小时,每2小时服用。

(iii) AM/PM相移实验,从DEX后48小时(“AM”)和60小时(“PM”)开始,在37°C下放置48小时,每隔3小时取一次样品。

RNA测序数据在Geo(GSE111696,GSE134333)上公开可用,作为原始数据和加工FPKM(每千次映射读取的每千次映射的碎片)值。

这三个实验中的常见条件(在DEX后37°C,48小时)提供了测试是否可以可重复地检测到循环转录物的机会。额外的一致性检查来自实验III,其中我们预计这两种情况会揭示一组常见的循环基因,相移12小时。应可靠地检测到真正的昼夜控制下的基因作为这些实验的循环。

我们检查了这些实验中节律基因的再现性。因为没有公布统计上显着的循环转录物的列表,我们重新分析了。使用作者说明的协议的数据:“通过去除任何时间点中具有零fpkm值的任何转录物来过滤数据,并且在随后的转换为fpkm值。。。雨(默认模式,独立方法)[(4.)]用于检测节奏转录物。。。使用以下参数:句点= 24小时,句点= 0或6,FDR <0.1或p -值< 0.05 " (15.)。默认ABH方法用于雨的基因内调整(4.),其次是Benjamini-Hochberg FDR(虚假发现率)在多种基因上调整(6.)。

我们以三种方式分析了结果。将循环成绩单的数量与报告的人进行了比较了(1)。我们将循环统计数据与三个实验进行了比较,以研究骑车者的再现性。最后,我们测试了实验III中的循环基因是否表现出预期的相移。

我们的分析未能重现(1)。我们在实验i中发现的循环转录本远远少于(1)[图。1A;与图1F (1)]。例如,我们发现了185个FDR < 0.1的基因BMAL1- / -与745年报告(1)。虽然有一些关于他们的方法的歧义,但没有合理的参数选择再现他们的计数。因为我们的分析使用已发布的FPKM值,所以我们的分析与(1)不能归因于对齐的差异。

Fig. 1 Reanalysis of transcriptional cycling in Bmal1+/+ and Bmal1–/– mouse skin fibroblast cells across three experiments performed by Ray et al.

(A) Genes detected as cycling in mouse skin fibroblasts at various significance levels for experiment i. P values were adjusted for multiple waveform tests using the ABH method of RAIN, followed by FDR correction across the multiplicity of genes. Relative to the values reported in figure 1E of (1), we identify far fewer cycling transcripts in both the wild type and the Bmal1–/– knockout. (B) Upset plot showing overlap in genes detected as cycling at FDR < 0.1 in all arms of experiments i to iii; blue and green bars indicate wild type and Bmal1–/–, respectively. Darker bars indicate the common 37°C, 48 hours post-DEX control condition; lighter bars indicate the experimental conditions (27° and 32°C in experiment ii; PM in experiment iii). The minimum set overlap is truncated at 25 for readability. Note that most genes detected as cycling are unique to a particular dataset and not reproduced by others. Inset: Untruncated upset plot for the common 37°C, 48 hours post-DEX control condition. (Overlaps between control arms may include genes that also overlap in non–control arms, shown in the main plot.) Note again that few genes are detected reproducibly among all three datasets despite the common conditions. Upper right: Scatterplots (upper triangle), histograms (diagonal), and rank correlation coefficients of FDR-adjusted P values for the common genes in the 37°C condition of the three experiments. Red lines in the upper triangle indicate FDR = 0.1, with points displayed on a –log10 scale; genes above the lines on this plot have FDR < 0.1. In the lower triangle, conditional probabilities of having FDR < 0.1 along the y axis given FDR < 0.1 along the x axis (and vice versa) are also shown. (C) Relationship among AM FDR, PM FDR, and AM-PM phase difference in experiment iii. Significant genes at FDR < 0.1 lie above 1 on the –log10 scale; the most significant cyclers lie close to the upper right corner. Highly significant genes tend to have large phase differences in Bmal1+/+; this is not observed in Bmal1–/–.

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图。1 转录循环的再分析BMAL1+/+BMAL1- / -Ray对小鼠皮肤成纤维细胞进行了三个实验

一种)在各种意义水平的实验I处于小鼠皮肤成纤维细胞中检测到循环的基因。P.使用RAIN的ABH方法调整多波形测试的值,然后对基因的多样性进行FDR校正。相对于图1E所报的数值(1),我们在野生类型和野生类型中识别较少的循环转录物BMAL1- / -淘汰赛。(B.)在实验I至III的所有武器中,显示为在FDR <0.1的循环中检测到的基因重叠的镦粗图。蓝色和绿色棒表示野生类型和BMAL1- / -,分别。较暗的线条表示常见的37°C, dex控制后48小时的情况;较轻的条表示实验条件(实验二为27°和32°C;为提高可读性,将最小集重叠截断为25。请注意,大多数被检测为循环的基因对特定的数据集是独一无二的,不会被其他数据集复制。插图:未截断的倒置图,用于常见的37°C, dex对照后48小时。(如主图所示,控制臂之间的重叠可能包括非控制臂的重叠基因。)请再次注意,尽管有常见的条件,但在所有三个数据集中几乎没有可重复检测到的基因。右上:fdr调整后的散点图(上三角形)、直方图(对角线)和秩相关系数P.三个实验37℃条件下常见基因的值。上三角形中的红线表示FDR = 0.1,在-log上显示点数10规模;在该图中的线上的基因具有FDR <0.1。在较低的三角形中,沿着沿着FDR <0.1的条件概率y轴给出FDR <0.1沿着X还显示了轴(反之亦然)。(C)实验三AM FDR、PM FDR与AM-PM相位差的关系。FDR < 0.1的显著基因-log值在1以上10规模;最重要的骑车者靠近右上角。强度显着的基因往往具有大的相差BMAL1+/+;这没有观察到BMAL1- / -

三个实验具有常见的控制条件(恒定的暗度,37℃,在DEX处理后48小时开始采样),其中仅采样的长度和频率不同。虽然采样选择会对循环检测产生影响,但三个实验中的采样方案具有可比性(7.)。因此,在所有三个实验中应可重复地检测到昼夜昼夜控制下的基因。然而,在所有三个实验中循环,很少有什么基因被循环:野生类型中只有26个转录物和四个转录物BMAL1- / -通过fdr <0.1(图。1B),其中只有一个是注释基因(Clk4)。这表明绝大多数“有节奏的”转录本缺乏可重复性。如果探测在另一个数据集中是有节奏的(FDR < 0.1),那么结果的重叠可以通过条件概率进一步量化。8.)。完美的再现性将是1,而再现性比机会更好是0.1。观察到的条件概率低,范围为0.01至0.3,中值为0.12(近似的机会)。我们还发现FDR调整后的低秩相关性P.值,这意味着在一个实验中排名高的循环者在其他实验中排名一般不高。这种不可重现性在BMAL1- / -敲除和野生类型;值得注意的是,野生型和BMAL1- / -P.基因型内的值并不比基因型间的值更一致(图。1B插图)。

在实验iii中,我们预计在AM和PM条件下都能检测到昼夜节律基因,尽管相移(反映较早的DEX脉冲)。虽然雷。显示“代表性”节律基因显示相移[图2,F和G, (1)],没有报告系统分析。我们计算了在AM和PM中通过FDR <0.1和FDR <0.05的基因数量,以及它们的相差(表格1图1C.)。AM和PM之间的节律重叠相对较少,尽管预期它们应该是一致的。在AM和PM中检测到在FDR < 0.1处循环的基因中,大多数表现出比预期小得多的相位差异BMAL1- / -表格1)。这种效果在FDR <0.05时更加明显,其中强骑车者倾向于具有预期的大相差BMAL1+/+但不是在BMAL1- / -表格1图1C.)。这表明观察到的振动BMAL1- / -不与DEX脉搏同步。

表格1 在AM和PM条件下,FDR < 0.1(无括号)和FDR < 0.05(括号)显著循环的基因在AM和PM条件下的相位差分布。

在两种基因型中,一个基因在AM中FDR < 0.1的条件概率都小于0.2,这表明AM和PM之间的循环基因通常很少有重叠。大多数强循环体在野生型中表现出预期的大的相位差,而在野生型中则表现出小的相位差BMAL1- / -(野生型FDR < 0.05基因间的中位相差为9小时,而野生型为3小时BMAL1- / -)。分布之间的分配显着差异BMAL1+/+BMAL1- / -,阶段BMAL1+/+高于in.BMAL1- / -P.< 0.0001, Fisher确切检验)。

请注意,原始版本(1)表示使用雨“纵向”方法,并未提及基因的过滤;这是后来更新的(5.)。使用原始设置的结果可以在我们的代码库中找到;尽管输出不同,但关键结果(缺乏再现性和内部一致性)没有改变。

我们的分析表明,在任何给定的研究中检测到作为“循环”的各种基因可能是误报(7.8.)或实验性工艺品。事实上,大多数节律性基因都不是可重复循环的,这与之前的观察结果一致,即RAIN有很高的假阳性率(7.8.);然而,我们使用JTK_CYCLE (9.)和Arser(10)。杂散循环也可能从与环境或细胞之间的相互作用(11)。虽然我们不能排除可能有昼夜节律动力学BMAL1- / -,我们没有发现任何证据表明这些数据中一直观察到的昼夜节律。

参考文献

致谢:我们感谢M. Rosbash和J. Hogeresch分享他们对光线数据集的独立分析,以及审阅者的有用评论。资金:NSF授予1764421和Simons基金会授予597491-RWC作为NSF-SIMONS的一部分,是西北大学的NSF-SIMONS。作者捐款:e.n.c.,R.A.和R.B.构思了这项研究;E.N.C.和R.B.进行了分析。所有作者都致力于稿件。利益冲突:一个也没有。数据和材料可用性:从Geo(GSE111696,GSE134333)获得数据。R码重现我们的结果(以及附加分析)可从https://bitbucket.org/biocomplexity/bmal1tech

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